在体外转录（IVT）过程中获得的mRNA反应混合物中，除了我们期望的mRNA产物外，还含有多个杂质，如蛋白质（例如T7 RNA聚合酶和无机焦磷酸酶）、NTP、模板DNA、盐离子和各种添加剂，以及在IVT过程中形成的mRNA副产物（如dsRNA和截断RNA片段）。这些杂质的存在可能会影响mRNA的功能，导致定量不准确、翻译效率降低或免疫原性改变。因此，需采用纯化技术将目标mRNA从IVT混合物中分离，以确保其纯度和完整性，从而保障产品的安全性与有效性。常见的mRNA纯化方法包括氯化锂（LiCl）沉淀法、硫酸铵沉淀法、磁珠纯化法、硅胶柱膜纯化法和层析纯化法。虽然沉淀、磁珠和硅胶柱等方法操作简便快速，适用于科研和早期研发，但在工业生产中，层析纯化则是主要的纯化方法。

2024年1月，中科院过程工程研究所的张松平团队发表的研究探讨了硫酸铵沉淀法的可行性，研究对象为增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码的mRNA。当硫酸铵浓度达到18M时，mRNA的沉淀率超过95%。进一步提升硫酸铵浓度时，沉淀率无明显变化。同时，溶解率也是一个重要指标，决定了mRNA的最终回收率。研究结果显示，在室温下，当硫酸铵浓度高于18M时，沉淀物能在3分钟内迅速溶解于无RNase的水中，溶解率超过90%。最佳沉淀条件推荐为2M硫酸铵（pH 7.0，温度20℃，沉淀时间2小时），可实现接近100%的沉淀率。

在比较硫酸铵和LiCl沉淀法的效果时，两者对NTP的去除率均超过99%，而DNA模板的去除率分别约为82.08%和85.88%。然而，硫酸铵沉淀法在去除T7聚合酶方面的效率低于LiCl。这一优势使得硫酸铵沉淀法可在室温下操作，从而有利于放大的生产过程。

硅胶柱膜纯化法则基于硅胶膜表面硅醇基团与mRNA分子之间的相互作用。在高盐环境中，阳离子桥的形成有助于中和mRNA和硅醇基团的表面负电荷，从而促进其结合。而在低盐或水溶液中，硅胶膜释放mRNA，同时，硅胶膜对蛋白质、多糖和脂类等杂质的吸附性较弱，使其能够通过高速离心有效分离杂质。硅胶柱膜法使用的材料安全无毒，符合环保标准，保护实验人员的健康并减少环境污染，因此在实验室和早期研究阶段得到了广泛应用。

在工业级的mRNA纯化中，常用层析法进行高效核酸质量及产能的提升。目前，主流的mRNA纯化方法是Oligo(dT)亲和色谱。由于这种方法与Poly(A)尾的杂交无法区分带有Poly(A)尾的ssRNA和dsRNA等杂质，通常会结合疏水层析及阴离子层析以提高纯化效率。Oligo(dT)亲和层析的原理为“高盐结合，低盐洗脱”，在适宜的条件下可实现较高的纯化率，且该工艺有助于mRNA的规模化生产。

目前，工业端大部分mRNA纯化工艺流程为：TFF1-层析-TFF2。TFF1步骤旨在减少蛋白质、DNA模板、NTP等杂质，并成功置换缓冲体系；层析步骤则主攻mRNA的捕获和dsRNA等杂质的去除；TFF2步骤将目标产物转移至最终制剂缓冲液中。在IVT产物质量较高的情况下，可以通过添加蛋白酶K与TFF的工艺进行高效下游纯化。蛋白酶K能有效去除与核酸结合的蛋白质杂质，而结合适宜的膜孔径，能提升纯化流程的效率并降低成本。值得注意的是，蛋白酶K可能具有一定的免疫原性，可能影响mRNA疫苗的安全性。如何优化其添加量，确保有效去除结合杂质，同时保持mRNA完整性，是实际应用中的重点。

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