## 培养条件

在进行细胞培养时，尊龙凯时建议的气相条件为95%空气加5%二氧化碳，适宜的温度为37℃。初次传代时，建议采用1:2的比例。

## 传代方法

在细胞培养的过程中，需要特别注意传代的时机和方法。若细胞的生长状态良好，可在2天后更换培养液。同时，我们建议您在购买细胞时选择尊龙凯时的优惠套餐，以获得更多价值。收到细胞后，及时将其培养至良好状态，并在把瓶口封好前添加完全培养液，这是运输细胞的最佳方法。

当收到细胞时，请使用75%酒精彻底喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后将其放置于超净台内进行严格的无菌操作。接着，将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以帮助稳定细胞状态。随后，可以通过显微镜观察细胞的生长情况，并拍照保存不同倍数的细胞图像（推荐40x、100x、200x各一张）。前三天的照片将成为重要的售后依据，如未提供照片，则默认细胞状态良好。

## 细胞培养步骤

### 细胞传代

1. 如果细胞未达到80%的汇合度，将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基并放置于37℃、5% CO2的培养箱中培养；若细胞密度超过80%，则可以进行传代培养。

2. 对于贴壁细胞传代，首先弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS进行1-2次洗涤；然后添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，并在37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态。如细胞大部分变圆并脱落，需迅速返回操作台，轻轻敲击培养瓶后加入5ml以上完全培养基以终止消化。

3. 将细胞轻轻吹打至完全脱落后吸出，转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。

4. 按1:2比例进行分瓶传代（可分入两个T25瓶），并补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

### 悬浮细胞传代

1. 采用半换液法，竖着放置培养瓶在培养箱中静置约1小时后，轻轻吸去约3ml培养基，然后添加3ml完全培养基。如果培养基变色较慢，可以直接补加500μl FBS，传代时则可直接添加5ml培养基分入两个培养瓶。一般情况下，这样的传代可以进行3次左右后，再进行一次离心传代以去除死细胞。

2. 若需分瓶，可采用离心换液法，收集细胞悬液至离心管，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清后补加1-2ml培养基，重悬混匀并按1:2比例分配至新T25瓶中，添加6-8ml准备好的新完全培养基，以保持细胞的生长活力。后续传代可根据实际情况调整为1:2至1:5的比例。

### 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并使用PBS清洗一次；

2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞状态，待细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液以终止消化。轻轻吹打使细胞脱落，并将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟；

3. 弃去上清，加入1ml尊龙凯时的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中；

4. 将冻存细胞直接置于-80℃冰箱中，若后期需转移至液氮罐，应在-80℃条件下存放24小时以上后再进行转移。

### 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速将其放入37℃的水浴中进行解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭外壁；

2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟；

3. 弃去上清，重悬细胞于5ml完全培养基中并接种至T25培养瓶，再置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养；

4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

## 注意事项

需要特别注意的是，有些细胞在运输过程中可能会因为附着不牢而脱落，这是正常现象。如果发现脱离的细胞较多，请将所有培养液收集至离心管，进行1000RPM离心5分钟。收集上清用作过渡培养，并加入1-2ml胰酶轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基以终止反应，然后再离心、弃上清，重悬至合适浓度。

最后，按照1:2的比例进行分瓶传代（分入两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，再次放入37℃、5% CO2培养箱中进行培养。